DNA微卫星【太湖地区与皖南地区中华蜜蜂微卫星DNA遗传的效果观察】
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DNA微卫星【太湖地区与皖南地区中华蜜蜂微卫星DNA遗传的效果观察】

2019-10-14 08:01:23 投稿作者: 点击:

太湖地区与皖南地区中华蜜蜂微卫星DNA遗传的效果观察

太湖地区与皖南地区中华蜜蜂微卫星DNA遗传的效果观察 DNA聚 配制3%琼脂糖凝胶,点样6 μL,20 V电泳20 min,检 查产物的有无。如有产物,配制8%聚丙烯酰胺凝胶80 mL体 系,00 V预电泳5 min,点样0 μL,20 V电泳3 h。进行硝 酸银染色,直至出现清晰的等位基因条带。

4荧光引物的筛选和组合 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果,尽量选择不同染色体 上的标记,淘汰掉无法扩增以及无多态性的引物,最终选出 相对较理想的2对多态性较丰富的微卫星引物:
7-CL278Contig()、5-CL4Contig(γ)、39-CL308Contig6 (X)、7-CL462Contig5(S)、8-CL470Contig3(T)、 37-CL293Contig(W)、29-CL229Contig33(K)、 28-CL650Contig3(B)、33-CL360Contig4(L)、 -CL229Contig27(M)、4-CL549Contig3(R)、-CL33Contig4 (Q)。每对引物的上游 5′ 端分别用荧光染料FAM(蓝色)、 HEX(绿色)、TAMRA(黄色)进行标记,获得的荧光标记引 物避光保存。按照微卫星引物的碱基长度进行组合,为了便 于区分得精确一些,组合的引物长度至少相差 20 bp,获得 的5个荧光标记微卫星引物组合信息见表3。

CR荧光产物STR分型送至上海生工生物工程有限公司进 行,使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪检测。上 样的总体积为35 μL,其中的上样液Hi-Di Formamide 0 μL、GS-500 Size Standard 05 μL,另外的3 μL为混合CR 产物。将Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard 混合 均匀后与等量的同一个体的CR产物进行混合,然后进行个体 编号,依次加样到96孔板中,接着变性和检测。检测结束后, 使用GeneMapper 40软件自动生成独立的图谱文件,读取片 段长度、峰值和峰面积,判断纯合子和杂合子(单峰为纯合 子,双峰为杂合子),最后导出Excel数据表格。

6遗传多样性分析公式 6等位基因频率 [Z]i=(2niinijnij2…nijn)/(2N)。

其中:i为第i个等位基因频率;
nii为第i个等位基因纯 合个数;
jn为与i共显的第n个等位基因;
nij为含i与jn共显 的等位基因个体数;
N为群体中个体数。

62杂合度 [Z]He=-∑[DD(]ki=-[DD)]2i。

其中:k为等位基因数;
i为第i个等位基因频率。

63多态信息含量 [Z]IC=-∑[DD(]ki=[DD)]2i-∑[DD(]k-i=[DD)]∑[DD (]kj=i[DD)]22i2j=2∑[DD(]k-i=[DD)]∑[DD (]kj=i[DD)]ij(-ij)。

其中:k为等位基因数;
i为第i个等位基因频率;
j为第 j个等位基因频率。

64群体内近交系数[Z]Fis=(Hs-Ho)/Hs。

其中:Ho为观察杂合度;
Hs为平均期望杂合度。

65统计分析 利用Microsatellite-Toolkit软件根据GeneMapper 40 软件导出的Excel表格来计算等位基因频率与期望杂合度, 根据Botestein等的公式设计、计算群体的多态信息含量, 再根据FSTAT程序计算群体内近交系数。

2结果与分析 2DNA提取结果 DNA提取出来以后,将其稀释到00 ng/μL,部分琼脂糖 凝胶用紫外透视成像系统检测,其结果如图所示:纯度比较 高,无拖尾现象。

[FK(W0][TTtif][FK)] 22荧光产物STR分型结果 使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自动测序仪进行检测 扫板,得到的部分微卫星引物的扩增结果与STR分型结果见 图2。图2所示的是太湖地区中蜂DS0个体在B位点的扩增结果, 基因型为32/34(杂合子);
皖南山区中蜂X03个体在T位点 的扩增结果,基因型为32/32(纯合子)。

23太湖地区与皖南山区中蜂优势等位基因的比较 由表4可见,利用配对试验均数差异双尾t检验对2个群 体优势等位基因频率进行处理,结果i=0356>005,即太湖地 区与皖南地区中蜂群体在这2对微卫星引物标记上检测出来的优势等位基因差异不显著。

24群体间相关参数分析 由表5可知,太湖地区中蜂群体的He、IC、Fis平均为055、 059、0053,均略高于皖南山区中蜂群体(0473、0423、025)。

对2个群体的He、IC、Fis进行t检验,结果显示,2个群体的 3个参数差异均不显著([HT5”]He=039、IC=0260、Fis=0428)。

3结论与讨论 从2006年开始,陆续有研究者利用西方蜜蜂微卫星标记 对我国中蜂遗传资源及遗传多样性进行分析,但普遍方 法是在CR扩增后采用聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的 方法,通过人为观察主观地对多态性条带进行分析,这种方 法最令人质疑的在于很难将相邻近的2个条带准确区分开来, 从而造成判型误差[7-8]。目前利用荧光引物扩增的微卫星 位点具有较高的分辨率和灵敏度,对扩增产物在单碱基水平 和表达量方面也具有较高的准确性。本试验利用ABI基因测 序分析仪对荧光标记DNA片段进行检测,并利用分子量内标 对DNA片段长度进行计算,使2个地区的中蜂STR分型方法较 传统方法更精确,更能真实反映2个群体内的遗传多样性及 群体间的遗传分化。

本研究在笔者所在课题组对中华蜜蜂转录组测序结果 所获得的 3 000 多个微卫星位点基础上筛选出2个微卫星位 点,尽量保证其在多条染色体或连锁群中都有分布,因此得 出的数据有一定的代表性和可比性。群体中频率最高的等位基因是该物种中最原始、最保守的等位基因,其余等位基因 是进化[CM(25]过程中由该等位基因突变形成的,因此微卫 星的多态性能 2K2]够反映物种的进化历史[2]。本研究发现2个群体的 优势等位基因频率间存在差异,但差异不显著(i=0356>005), 表明太湖地区中蜂群体(DS)与皖南地区(X)各自维持着 一定的种质特性,但两者之间遗传分化较小。这可能与这2 个地区相隔距离较近、两者基因流动值较高有关,表明从皖 南山区引入部分中蜂蜂群,扩大太湖地区中蜂种群数量,进 行蜂蜜生产与授粉,不会对当地中蜂遗传资源产生较大影响。

多态信息含量是衡量基因片段多态性较好的指标,当 IC>05时,该座位为高度多态性座位;
当025 期望杂合度 别称基因多样度,是一个度量群体遗传变异的最适参数[4]。

本研究所选用的微卫星标记中,、γ、T、R、Q、X、W等7个 标记有较高的多态性,群体遗传多样性丰富,具有较高的选 择潜力;
而B标记在2个群体间表现出完全不同的多态性,其 在皖南山区中蜂群体中为纯合子,而在太湖地区群体中表现 为高度多态(He=0875),今后可将其作为候选遗传标记区 别2个地理群体。

本研究通过对太湖地区与皖南山区中蜂群体进行遗传 多样性检测,对2个群体主要遗传参数进行比较,结果显示, 2个群体间的He、IC、Fis差异均不显著,其中太湖地区中蜂 群体的He、IC还略高于皖南山区,表明太湖地区中蜂遗传多样性仍较丰富,这可能与太湖地区蜜源植物资源丰富,适宜 中蜂生存,同时该地区与种群数量较多的浙北和皖南山区没 有明显的地理隔离,造成相互基因流动有一定的关系。这也 说明在分析中蜂群体遗传多样性时,种群数量与其拥有的遗 传多样性高低没有直接联系。

综上所述,本研究利用筛选后的2个微卫星DNA荧光标 记分析了太湖地区与皖南山区中蜂群体的遗传多样性与群 体间的差异,结果表明,2个地理群体遗传多样性均较丰富, 具有较高的保种价值,且两者间遗传分化不明显,完全可能 从皖南地区引入中蜂蜂群扩大太湖地区种群数量。

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