哺乳动物胚胎 哺乳动物胚胎切割技术研究及应用进展
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哺乳动物胚胎 哺乳动物胚胎切割技术研究及应用进展

2019-10-14 08:00:15 投稿作者: 点击:

哺乳动物胚胎切割技术研究及应用进展

哺乳动物胚胎切割技术研究及应用进展 胚胎切割是哺乳动物胚胎工程的重要组成内容,是应用 显微手术的方法,将一枚胚胎分割成二分、四分甚至八分胚, 经体内或者体外培养,然后移植入受体中,获得同卵双生或 同卵多生后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎数量的有效方法, 也是胚胎克隆技术的一种,其不仅增加了优秀个体数量,而 且还可将同卵双生后代用于各种试验研究,能排除遗传特性 差异所带来的影响,在科学研究和畜牧生产中具有重要的意 义。

1哺乳动物胚胎切割技术的研究进展 1901年Spemann首次将蛙的两个卵裂球分离开,人工产 生了双胞胎。1970年Mullen等将小鼠2-细胞胚胎的两个卵裂 球分开,经过体外培养后再移植给受体,产生了哺乳动物的 首次人工双胞胎。1978 Moustafa等将小鼠桑椹胚一分为二, 得到双胞胎。1979年Willadsen[1]和Meineck-Tillmann等分 别将绵羊2-细胞胚胎和桑椹胚一分为二,获得同卵双胞胚。

80年代以来,哺乳动物胚胎分割技术飞速发展。

Willadsen[2]等在总结前人的基础上,对胚胎分割进行了系 统的研究,创造出了毛细管分离法,并先后分离2、4、8细 胞绵羊胚胎,获得后代羔羊。毛细管分离法虽然具有较高的 同卵多生的优点,但需要琼脂包埋和中间体的体内培养,很 难做到与受体同期化,且操作复杂。1982年,Ozil等[3]把 分割后的牛的半胚分别装入空透明带内,移植获得同卵后代。后来,Gatica等(1984)简化的操作方法,将细胞团从切开 的透明带中取出,用玻璃针一分为二,再将半胚分别移入空 透明带中直接移植,获得了7只双胎。1984年,Williams等 [4]用显微手术刀分割牛桑椹胚和早期囊胚,获得9头双胎犊 牛。

后来,胚胎切割和性别鉴定技术结合起来,以及嵌合体 的应用,为胚胎切割技术扩大了应用和推广的范围。

我国胚胎切割技术的发展与应用20世纪80年代发展迅 速。1988年,谭丽玲[5]等分割兔半胚产仔,1989年张涌等 [6]山羊冻胚分割产羔,90年代前后分割牛羊成功,郭志勤 等于1989年获得奶牛冻胚分割植后产同卵双犊和1992年绵 羊鲜胚分割四分胚移植产同卵羔[7-8];
1989年牛四分胚成 功产犊。

通过胚胎分割技术还可获得性别和遗传上完全相同的 同卵孪生或多生后代,为遗传学、生理学、营养学等研究提 供宝贵试验材料。目前二分胚成功的有小鼠、兔、绵羊、山 羊、牛、马和人。四分胚成功的有兔、绵羊、猪、牛、马, 八分胚成功的有兔、绵羊、猪。

2胚胎切割方法 2.1微细管吹吸法 借助显微操作仪,在D-PBS培养液中,左手持固定吸管 吸住胚胎,右手操作玻璃微针切开胚胎透明带,细胞团即从 透明带中脱出,用毛细管吹吸胚胎,得到单个卵裂球,再将其装入空透明带中,体外培养至桑椹胚或囊胚期,移植入同 类受体中。此方法适于分离二细胞期到八细胞期卵裂球。

2.2显微手术法 在显微操作仪的帮助下,在D-PBS液内,用固定吸管吸 住胚胎,用玻璃针或显微手术刀将胚胎对称切割。这种方法 适于分割桑椹胚和囊胚期胚胎。

2.3徒手分割法 在立体显微镜下,徒手握住特制切割刀,在皿底部轻轻 划痕,然后将胚胎轻轻推入划痕处,通过增大摩擦力来固定 住胚胎,将刀片自上而下垂直切割胚胎,操作过程要快,一 刀切开。这种方法多用于切割桑椹胚和囊胚。

3影响切割胚成活效果的因素 3.1胚胎发育时期 不同发育时期的胚胎分割后,其发育能力是有差异的。

1984年,Williams 等[4]用显微手术刀分割5.5~7.5日龄牛 胚胎,晚期桑椹胚、早期囊胚和囊胚的半胚移植妊娠率分别 为47.5%、60.4%和53.6%。1989年,张涌等[6]分别利用不同 发育时期的羊半胚切割移植,结果晚期桑椹胚、囊胚、孵出 囊胚和孵出增大胚泡各组半胚生产羔羊的成功率分别为 12.5%、20%、25%、62.5%。1995年,马宝华[8]报道,安哥 拉山羊早期囊胚、囊胚和扩张囊胚的半胚移植后成羔率分别 为28.6%、33.3%和9.5%。由以上报道可以看出囊胚半胚的成 犊率高于来自于桑椹胚的半胚。3.2胚胎切割次数 四分胚的成活力、妊娠率、双胎率都远低于二分胚。1992 年窦忠英[9]等将18枚7日龄奶牛胚胎一分为四分割的半胚 移植给受体,只有9头受孕 ,受孕率为50%。Rho等[10] (1998 )发现四分牛的桑椹胚和囊胚只得到一个四分胚后代。

3.3透明带的完整性 透明带可以阻止微生物和病毒进入胚胎内部,对胚胎具 有一定的保护作用。但桑椹胚和囊胚时期,半胚有无透明带 对妊娠率没有太大影响。1995年,马保华等[8]用链霉蛋白 酶液软化透明带后分割胚胎,试验结果发现可降低半胚存活 率。Sotomaru等[11]曾发现,有透明带的分割胚比无透明带 的分割胚对冻融有更高的抵抗力。2000年赖双英[12]等用酶 分离小白鼠早期胚胎,获得的卵裂球没有透明带也能够继续 发育。张涌等[6](1989)对称分割山羊孵出增大胚泡,不装 透明带移植其裸半胚,仍可继续发育形成正常胎儿,而且获 得较高的同卵双生率。

3.4植入半胚的数量 许多学者研究表明,移植1枚半胚妊娠率低于同时移植2 枚半胚的妊娠率。Lambeth 等 (1983)对半牛胚移植研究表 明,同等条件下,移植1枚或2枚半胚于受体牛的黄体侧子宫 角后,妊娠率分别为 16.7%(1/6) 和62.5%( 5/8),而 且后者获3对同卵双生。Maurer等 (1988)将2枚绵羊半胚移 植于受体羊黄体侧或双侧子宫角各1枚时,妊娠率分别为57.1%和20.0%。马保华等[8](1995) 的实验也同样证明将 2枚裸半胚同时移植于受体羊黄体侧子宫角后,获得了较好 的结果。

3.5半胚在体外停留时间 Bader(1985)研究证明鲜胚分割后用血清PBS液培养4h 以上后妊娠率降低。陶涛等[13] (1991) 对奶牛胚胎分割实 验发现 ,半胚在体外滞留时间超过4 h和受体的黄体发育不 佳均显著降低半胚的受胎率。DearmasR(1986)报道在20% FCS- PBS液中培养2h的半胚,其存活力最高。可见,半胚在 体外停留时间对半胚成活力的影响较大,超过4个小时后存 活力会大大降低。

4胚胎切割技术的应用 4.1胚细胞核移植 胚胎切割可为基因治疗和基因活性的研究提供有利的 动物模型。早期胚胎细胞是一群遗传上同质的细胞,以胚胎 细胞作为核供体,进行动物核移植,可为各项研究提供大量 材料。Meng[14] 等(1997)将猕猴的单个卵裂球进行卵母 细胞注射,经过体外培养和移植后,生出一对不同性别的两 个后代。1998年,Le[15]等分离牛的单个卵裂球作为核供体, 生出克隆牛。

4.2构建异胚重构体 将供体的细胞核,移植到处于第二次减数分裂中期的去 核卵母细胞中,在卵母细胞相关因子的作用下,细胞核发生重编程恢复到发育的起点状态,重构胚具有重新发育成新个 体的能力。制作重构胚并将其移植到受体中,让其生长发育 成为新的动物,这也是制备转基因动物的方法。

4.3生产嵌合体 应用显微操作技术,将同种或异种胚胎的卵裂球分离出 来,装入同一个透明带内,将两个半胚融合在一起,经体外 培养后移植入受体中,嵌合体动物对于研究种间妊娠中母胎 之间的相互作用和母体的免疫识别有重要意义。

4.4胚胎性别鉴定 在胚胎移植前将胚胎切割约十分之一,然后将取下的部 分通过染色体分析、H-Y抗原抗体免疫学和PCR技术进行性别 鉴定,在胚胎早期即可得知胚胎性别,进而生产出已知性别 的动物,在动物的性别需要育种中意义重大。

4.5生产同卵双生后代 在牛上不仅可以移植半胚生产同卵双胎,增加后代数量, 而且可避免异性双胎不孕现象的发生。清家升[16](1991) 报道,每头受体牛移植两枚半胚和一枚半胚的胚胎着床率分 别53.8%和48.4%,同时移植两枚半胚的双犊率为15.4%,而 分别移植半的同卵双犊率为45.2%。

4.6保存珍稀家畜动物的种质资源 胚胎分割技术可以增加优秀种畜、濒危珍稀动物以及有 价值的转基因动物的数量,并且根据需要可长期保存这些动 物的物种。5小结 胚胎切割技术可使胚胎数量成倍地增长,获得到同卵双 生后代,在试验研究和濒危动物的保种中具有重要的应用价 值。但胚胎分割技术也存在半胚移植后的妊娠率和产仔率不 高,后代体质弱、体重低等问题,这需要研究者从胚胎分割 方法、分割胚的有效培养、保存方法等方面进一步研究,提 高分割胚的妊娠率,同时随着生物技术的不断发展,胚胎分 割技术的应用价值也会有更广阔的应用前景。

参考文献:
[1] Willadsen S M. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to produce monozygotic twins[J].Nature,1979,277:298-300. [2] Willadsen S M.Cloning of sheep and cow embryos[J].Gamete Res,1989,22:257-263. [3] Ozil JP. Production of monozygotic twins by micromanipulation and cervical transfer in the cow[J].Veterinary Record,1982:126-127. [4] Williams TJ, Elsden RP, Seidel GE. Pregnancy rates with bisected bovine embryos[J]. Theriogenology, 1984, 22(5): 521-531. [5] 谭丽玲,李乐义,廖和模,等.奶牛四分胚分割研 究[J].畜牧兽医学报,1992,23(4):289-294. [6] 张涌,钱菊芬. 山羊胚胎分割及同卵双生试验[J].畜牧兽医学学报,1989,20(2):97-101. [7] 郭志勤. 家畜胚胎工程[M].北京:中国科技出版社, 1998. [8] 马宝华. 安哥拉山山羊胚胎徒手分割和移植试验 [D].西北农业大学硕士论文,1995. [9] 窦忠英,王新庄,樊敬庄,等. 奶牛胚胎一分为四 移植试验[J].西北农业大学学报,1992,20(2):1-4. [10] Rho GJ, Johnson WH, Betteridge KJ. Cellular composition and vilbility of demi-and quarter-embryos made from bisected bovine morulae and blastocysts produced in vitro[J]. Theriogenology, 1998,50:885-895. [11] Sotomaru Y, Kato Y, Tsunoda Y. Production of monozygotic twins after freezing and thawing of bisected mouse embryos[J]. Cryobiology, 1998, 37:139-145. [12] 赖双英,菊林花,晁玉庆,等. 用酶分离小鼠早 期胚胎的研究[J]. 内蒙古农业大学学报,2000,21(3):
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