【如何提高ELISA测定的准确性】哪些条件会影响浓度测定值准确性
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【如何提高ELISA测定的准确性】哪些条件会影响浓度测定值准确性

2019-10-14 08:02:23 投稿作者: 点击:

如何提高ELISA测定的准确性

如何提高ELISA测定的准确性 近几年,畜产品质量安全意识与日俱增,动物疫病形势 复杂化,基层动物疫病防控部门做好动物疫病筛查工作显得 尤为重要。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其具有操作简便、 灵敏度高、特异性强等优点被广泛应用于血清、尿、饲料等 样品筛检中。ELISA 试验看似简单但在实际的操作中,影响 测定结果的因素较多,稍有不慎便会导致弱板、白板、花板 等不正常现象或假阳性、假阴性等异常结果。笔者对ELISA 测 定过程中出现一些问题进行了分析和总结,要想做好ELISA 试验需三个方面着手。

一、试剂 检测试剂应选择正规厂家、灵敏度高、特异性好、操作 方便省时的试剂,切忌混用同厂家生产的不同批号的试剂。

另外,试剂在使用前应平衡至室温(25℃), 这样可以避免 试验反应不充分、弱阳性样品检测假阴性结果等现象的发生。

此外,稀释试剂的水必须使用重蒸水或去离子水,其他水因 杂质过多或有酸碱度都会影响检测结果的准确性。

二、样品 1. 样品处理。ELISA 测定结果的判定是通过辣根过氧 化物酶(HRP)与特异性结合产生的抗原-抗体复合物相互作 用后显色与否来实现的。对样品筛选或处理要严格,否则会 直接导致结果呈假阳性或假阴性等异常现象。如溶血和被细 菌污染的样品、冰箱中保存过久的样品等导致假阳性出现;
反复冻融会使样品效价降低,导致假阴性出现。一般来说, 一周内测定的4℃~ 8℃冷藏保存,一周后测定的-20℃冷冻 保存,长期保存多次测定的样品要分装冰冻保存。

三、操作 1. 加样。首先加样不可太快,否则无法保证加样剂量 的准确性和均一性。其次要避免将液体加在反应孔壁上部, 可能会导致非特异性吸附。此外,要做到一份样品一个移液 抢头,以防交叉污染。

2. 温育。温育是ELISA 测定中的一个关键环节,只有 在一定适宜的温度和与之相对应的特定时间,液相中的抗原 (抗体)才能与固相载体上的特异抗体(抗原)充分结合。

不同试剂盒有不同的温育温度和时间的要求,应严格按试剂 盒说明操作,不能人为改变。此外,微孔板温育时要加贴封 片,这样可以防止孔内液体蒸发或水珠等杂质滴入孔内影响 检测结果。

3. 洗板。洗板是将温育过程中液相非特异性成分与反 应中固相载体的抗原(抗体)结合产生的抗原抗体清除出去, 从而保证ELISA 测定的特异性。同样,每个试剂盒对洗板的 次数和侵泡时间都有明确规定,绝不能擅自更改。此外,洗 涤液应现用现配,洗板时不要让洗液溢出,每次甩板拍干后 的吸水纸一定要更换,尤其是拍过酶标记物的吸水纸,否则 影响试验结果。

4. 显色。一般来说,显色时间过短,结果偏低,显色时间过长,对照值偏高或非特异性显色概率增加,因此,显 色一定要严格按照说明书要求控制好时间。此外,不同试剂 盒对酶标仪的波长有明确要求,上机时需稍加注意。

此外,在反应板上的整个操作过程,操作手法应一致, 加样时避免产生气泡,以免反应不完全或比色结果不准确。

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