复合性状转基因玉米外源蛋白的时空表达的效果路径 转基因玉米有哪些
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复合性状转基因玉米外源蛋白的时空表达的效果路径 转基因玉米有哪些

2019-10-14 08:00:47 投稿作者: 点击:

复合性状转基因玉米外源蛋白的时空表达的效果路径

复合性状转基因玉米外源蛋白的时空表达的效果路径 自998年首例转基因玉米被批准商业化以来,转基因 玉米种植面积不断扩大,随着转基因技术快速发展,新一代 转基因植物及复合性状转基因植物不断涌现。20年,全球共 有6个国家种植转基因玉米,种植面积达到5 00万hm2,占全 球玉米种植总面积的32%。抗虫耐除草剂复合性状转基因玉 米种植面积近2年来不断增长,202年种植面积达 2 029万hm2, 比20年增长09%。复合性状转基因玉米已逐渐取代了单一性 状转基因玉米,成为市场主导[2]。然而,转基因大面积种 植后引起的生态环境安全等问题也引起了人们的广泛关注 [3-4]。因此,对复合性状转基因玉米在不同栽培条件下外 源蛋白时空表达成为转基因环境安全评价的关注焦点之一 [5]。本试验材料为孟山都公司选育的DK007YGRR、DK008YGRR、 NC6304YGRR等3个复合性状转基因玉米品种,这3个品种均以 MON89034和NK603为亲本杂交选育而成,具有来自父本的 CryA05和Cry2Ab2杀虫蛋白基因和母本的C4-ESS蛋白外源基 因,表达双价抗虫和耐除草剂的复合性状。本研究采用ELISA 方法对3个复合性状转基因玉米不同时期、不同组织进行外 源蛋白表达的实时检测,研究复合性状转基因玉米抗虫和耐 除草剂基因的时空表达规律。同时,以本品种的同型对照品 种以及当地主栽品种作为阴性对照开展外源蛋白组织表达 测定,以期阐明杂交种外源蛋白时空表达规律,为杂交选育 复合性状转基因玉米环境安全评价方案提供参考依据。材料与方法 材料和试剂 [本文由WWw. dyLW.net提供,专业代写毕 业论文和教育教育职称论文,欢迎光临DYlw.neT] 阳性转基因玉米材料3个,品种名为DK007YGRR、 DK008YGRR、NC6304YGRR,同型对照阴性玉米样品分别为 DK007、DK008和NC6304,由美国孟山都公司提供。当地主栽 品种对照ZD958和C69为当地大田推广材料,购于种子公司。

3个转基因玉米材料均为MON89034(双价抗虫)和NK603(耐 除草剂)杂交选育的复合性状品种。

主要化学试剂采购于Sigma公司。

2田间试验设计和取样方法 2小区设计 NC6304YGRR和其同型对照NC6304、主栽品种对照ZD958 种植于吉林省公主岭市;
DK007YGRR、DK008YGRR,同型对照 DK007、DK008,主栽品种C69种植于广西;
每小区面积为30 m2 (6 m×5 m),3次重复,随机区组排列。

22播种时间与方法 吉林省202年5月2日播种,常规播种方式,播种后按当 地常规耕作管理模式进行管理。广西壮族自治区202年4月20 日播种,常规播种方式,播种后按当地常规耕作管理模式进 行管理。

23取样方法 [3]分抽雄前、抽丝、灌浆初期和乳熟末期4个时期取样,取样部位:苗期叶片、心叶期叶片、花粉与花丝、籽粒、雌 穗顶端和茎髓,取样后用液氮速冻,-80 ℃低温冰柜保存。

3ELISA试验方法 3样品处理和蛋白抽提 当在田间对测试材料的各个组织进行采样后,当天放入 实验室-80 ℃低温冰箱中进行保存,直至全部样品采集完毕, 开始样品处理。样品组织在处理时先粉碎成均匀的粉末样本。

样品称重后,对CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白用×BST进行 提取。提取的蛋白样品在6 h内进行测试时,保存在 4 ℃ 条 件下,否则用小管分装保存在-80 ℃条件下。

32C4-ESS蛋白检测方法 单克隆小鼠抗C4 ESS抗体用含50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3 缓冲液和 05 mol/L NaCl的溶液稀释至20 g/mL,每孔加00 L 稀释的抗体在96微孔板上固定,放入4 ℃冰箱孵育8 h以上。

用× BST洗板3次,分别在各孔对应加入C4-ESS蛋白标准液、 样本提取液、标准品和样品缓冲液00 L/孔,37 ℃下孵育 h。

秸秆、叶片、花粉、花丝和根样品提取液使用× BST/0% BSA 溶液稀释;
籽粒样品使用× TBA稀释。× BST 洗板3次,每 孔加入00 L过氧化物酶偶联的抗C4 ESS抗体,37 ℃孵育 h。

用× BST洗板3次,向孔内加入00 L TMB,室温静置0 min, 加入00 L 6 mol/L H3O4终止酶反应。C4-ESS蛋白水平定量 通过绘制0456~4600 ng/mL的C4-ESS蛋白标准曲线用内插法 确定。33Cry2Ab2蛋白检测方法 小鼠抗Cry2Ab2的捕获抗体用包被缓冲液(92 μL单克 隆抗体加到0 mL 50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3的缓冲液)稀释, 最终浓度为2 μg/mL,每孔加00 μL稀释抗体在96微孔板上 固定,放入4 ℃冰箱孵育 8 h 以上。用×BST洗板3次,分 别在各孔对应加入 00 μL Cry2Ab2蛋白标准液、样品提取 液、标准品和样品缓[2]冲液(00 μL/孔),37 ℃孵育 h。

×BST洗板3次,每孔加入00 μL生物素偶联的山羊抗Cry2Ab2 抗体和NeutrAvidin-HR(ierce)来检测捕获的Cry2Ab2。× BST洗板3次,每孔加入00 μL TMB显色。向各孔中加入00 μ L 6 mol/L H3O4终止酶活反应。通过绘制浓度为029~7000 ng/mL的Cry2Ab2蛋白标准曲线,用内插法完成定量。

34CryA05蛋白检测方法[2] 山羊抗CryA05的捕获抗体用包被缓冲液(50 mmol/L Na2CO3/NaHCO350 mmol/L NaCl)稀释至终浓度3 μg/mL, 每孔加00 μL稀释抗体在96孔微孔板上固定,放入4 ℃冰箱 中孵育8 h以上。用×BST洗板3次。进行籽粒样本分析时, 向各孔加00 μL含9%脱脂奶粉(NFDM)的×BST,再进行封 闭,37 ℃孵育 30~90 min,用×BST洗板3次,其他组织样 本不进行此步骤。分别在各孔对应加入00 μL CryA05蛋白 标准液或样品提取液,37 ℃孵育 h。用×BST洗板3次,每 孔加入 00 μL 生物素偶联的山羊抗CryA05抗体和 NeutrAvidin-HR(ierce)来检测捕获的CryA05。用×BST洗板3次,每孔加入00 μL HR底物3,3′,5,5′-四甲基联 苯胺(TMB)显色。向各孔中加入00 μL 6 mol/L H3O4终止 酶活反应。通过绘制0438~4000 ng/mL CryA05蛋白标准曲 线,用内插法完成定量。

4数据统计和分析 ELISA研究中采用Bio-rad iMarkTM 微孔板吸收光酶标 仪进行检测。CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白用波长450 nm 时的吸光度和波长655 nm时的参考吸光度来确定其在样品中 的表达量,在计算时根据标准蛋白所建立的标准曲线和内插 法。蛋白的标准浓度用四参数逻辑曲线模型确定曲线,用内 插法确定CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白在各样品中的含量, 并将结果由ng/mL转化为μg/g(鲜质量)。数据用ELISA软 件进行归纳分析。

2结果与分析 2组织中外源蛋白表达的差异显著性分析 本试验的3个复合性状品种分别在吉林省和广西壮族自 治区两地栽种,3个复合性状转化体,均为MON89034和NK603 的杂交选育品种。3个转基因玉米材料的遗传背景的外源基 因具有来自父本MON89034的双价抗虫基因 ([WTBX][STBX]CryA05、Cry2Ab2[WTBZ][STBZ])和来自母 本的NK603耐除草剂基因 ([WTBX][STBX]C4-ESS[WTBZ][STBZ])。采样时期分别为苗 期(V4)、心叶期(V8)、吐丝期(R)和灌浆期(R3),各时期采集的组织为V4 叶片、V8叶片、R花粉和花丝,R3籽 粒、穗尖(雌穗顶端)、茎髓(雌穗着生节茎秆),在各小 区中对每个组织材料随机选取5株进行蛋白提取。

对3个平行小区开展3次重复ELISA检测,根据405 nm吸 光度的数值在标准曲线中对照其蛋白在转基因玉米植株中 的外源蛋白表达含量。

表统计分析了3个复合性状转基因品种的 C4-ESS 蛋白 在7个不同生长时期的组织中的表达情况,结果表明,同一 组织内的蛋白表达在品种间多差异不显著,特别是叶片组织, V4叶片(新鲜)和V8叶片(新鲜)的 C4-ESS 蛋白持续稳定 地高表达,均约为35 μg/g,其他组织在品种间或有差异, 但各组织间表现了更大的差异显著性,方差分析结果见表2。

表3分析了3个复合性状转基因品种的CryA05抗虫蛋白 在7个不同生长时期组织中的表达,该抗虫蛋白在各组织中 表达差异较大。统计分析结果表明,3个品种同一组织蛋白 表达量不同, 但差异均不显著,而组织间V4叶片、V8叶[FL)] 可见,复合性状的转化体组织表达外源蛋白在转化个体 间变异不明显,其表达量与表达蛋白种类有关。组织间的差 异大于品种差异,栽培种植条件也是影响其蛋白表达的原因 之一。

22抗虫和耐除草剂基因在转化体中的蛋白表达 由图、图2、图3可见,转基因植株中耐除草剂蛋白 C4-ESS 在V4叶片、V8叶片、花粉、茎髓、穗尖、籽粒中表达量均高于CryA05、Cry2Ab2抗虫蛋白,只有在花丝中3种蛋 白表达量均较低的情况下,Cry2Ab2蛋白表达量略高于 C4-ESS。

CryA4、Cry2Ab2 2种抗虫蛋白的表达量在3个品种中表 现趋势也较明显,CryA05抗虫蛋白在V4叶片、V8叶片、花粉、 穗尖组织中的表达量高于Cry2Ab2抗虫蛋白;
仅在3个品种的 花丝、广西品种DK007YGRR和DK008YGRR茎髓和籽粒中, Cry2Ab2表达的抗虫蛋白量略高于CryA05。

因此,3个品种显示的耐除草剂和抗虫蛋白的组织表达 规律一致,其外源蛋白的表达量可能与在其亲本来源有关, 在亲本中的基因插入位置和表达调控可直接影响到其在杂 交品种中的表达。

23植物各组织中外源蛋白的鲜质量含量 如图4、图5、图6所示,3个复合性状品种DK007YGRR、 DK008YGRR、NC6304YGRR在各组织中表达情况也显示出较高 的一致性,即营养器官组织(V4叶片、V8叶片)的外源蛋白 表达量均高于生殖器官(花丝、花粉、穗尖、籽粒、茎髓)。

V4叶片中3种外源蛋白表达最高,V8叶片其次,这一结果可 能与叶片中可溶性蛋白含量较高有关。[2] 在3个转化体中,NC6304YGRR各时期的植物组织器官中 CryA05蛋白表达量最高,DK007YGRR其次,DK008YGRR中表达 相对较低。

在植物的营养器官中,NC6304YGRR的Cry2Ab2蛋白表达量最高,而生殖生长阶段中NC6304YGRR生殖器官(花丝、花 粉、穗尖、籽粒、茎髓)中Cry2Ab2蛋白表达量均低于 DK008YGRR。

在苗期和心叶期,3种转化体叶片中C4-ESS蛋白表达量 最高,其中V4叶片时期略大于V8叶片时期,这种情况可能与 前期转化体筛选有关。这一时期叶片的高表达量为草甘膦喷 施效果提供了有效保证。

24植物生长条件对转化体外源蛋白组织表达的影响 NC6304YGRR是在吉林种植和栽培管理的玉米品种, DK007YGRR、 DK008YGRR在广西栽培种, 因此植株生长的环 境条件有所不同。生长在吉林的NC6304YGRR 的CryA05蛋白 表达量基本均大于生长于广西的DK007YGRR、DK008YGRR。

Cry2Ab2蛋白和C4-ESS蛋白表达量两地各不相同,无明显规 律。复合性状转基因品种各组织中的外源蛋白表达量存在差 异,且在相同条件栽种的DK007YGRR、DK008YGRR蛋白表达量 同样存在差异,但差异较小。

3结论与讨论 转基因植株外源基因蛋白在不同生育期不同组织器官 表达不同[6],既可能与外界栽培条件有关,也可能与外源 基因整合的位点有关[7]。当外源基因整合到与生长发育有 关的基因附近,外源基因的表达就会受生长发育基因调控序 列的调控,随着生长时期的不同而发生变化。

本研究结果表明,在转基因玉米各生长时期中,抗虫Bt蛋白含量均未明显减少,其抗虫的表达量趋于稳定,能够持 续地进行抗虫表达,因此能够达到更好的抗虫效果。在玉米 不同生长发育阶段的组织中,苗期叶片转基因蛋白表达量明 显高于心叶期叶片。这可能与表达不同时期的环境条件有关, 也可能与发育阶段中基因的表达调控相互关联。

在苗期和心叶期,3种转化体中,叶片C4-ESS蛋白表达 量最高,其中V4叶片时期略大于V8叶片时期,这种情况可能 与前期转化体筛选有关。这一时期叶片的高表达量为草甘膦 喷施效果提供了有效保证。3个复合性状品种的 C4-ESS [2] 蛋白均来源于转基因玉米品种NK603,因此笔者认为,通过 杂交育种的复合性状转基因转化体对其亲本的安全评价可 作为复合性状杂交种的安全评价的数据参考,其外源基因表 达可能直接决定亲本多种杂交后代中外源基因的表达。

由于NC6304YGRR是在吉林种植和栽培的管理玉米材料, DK007YGRR、DK008YGRR在广西栽种,因此植株生长的环境条 件有所不同,组织间外源蛋白表达呈现差异。这与文献中所 述转基因植物外源基因表达与生长自然环境条件、栽培管理 措施密切相关的结论相一致。而在相同条件下栽种的 DK007YGRR、DK008YGRR同样存在表达蛋白量的差异,但差异 较小。因此,组织表达与蛋白种类相关性更强,即与转入的 外源基因的本身构建及插入基因组位置有显著的相关性,该 研究结果与其他作物的转基因外源蛋白表达调控影响的研 究[8-9]相一致。有研究表明,杂交本身对于外源基因的表达存在影响[0],复合性状玉米与其亲本的表达差异和调控, 有待于进一步研究。

ELISA方法是直接检测转基因植物体内外源蛋白表达量 的手段之一,具有快速、简单、低耗、结果客观、易判定等 特点。本试验的Bt蛋白和C4-ESS蛋白最低检出量为05 ng/mL, 灵敏度较高。每样品均作平行检测,并设立阴性和空白对照, 提高了检测的准确性与可靠性。ELISA方法的检测也受到检 测环境温度、湿度的影响,因此每次检测要在环境相同的条 件下进行,并且每次均须同时作空白及标准曲线,以减小误 差。穗尖、花丝及花粉的外源蛋白含量比其他部位的含量低, 因为这些部分的可溶性蛋白本身含量就低,多为纤维素及其 他物质[2]。外源蛋白含量用 g鲜质量中含量表示时,结果 受样品本身含水量的影响较大,导致有一定的误差。

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